涎腺腺样囊性癌细胞转移潜能与细胞外基质的关系

芊宇千寻点

　　【摘要】　目的　了解不同转移能力的涎腺腺样囊性 癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)细胞与细胞外基质粘附、对细胞外基质侵袭及趋化运动的能力。方法　MTT法测定SACC-LM，SACC-83，ACC-M，AC C-2与纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、Ⅳ型胶原的粘附，用改良Boyden chamber方法观察了SAC C细胞对人工重组基底膜的侵袭以及趋化运动。结果　高转移的SACC- LM与细胞外基质的粘附低于SACC-83，而ACC-M与细胞外基质的粘附高于ACC-2。SACC与纤维粘连蛋白的粘附高于和层粘连蛋白、Ⅳ型胶原的粘附。SACC-LM，ACC-M的侵袭和运动能力强于SACC-83，ACC-2。结论　不同转移能力的SACC细胞与细胞外基质的粘附能力不同。高转移潜能的涎腺腺样囊性癌细胞的侵袭能力、趋化运动能力较强。
　　【关键词】　涎腺腺样囊性癌　　肿瘤转移　　细胞外基质
　　在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞和细胞外基质(extracellular matri x,ECM)的关系非常密切，其中主要的有肿瘤细胞与ECM的粘附、肿瘤细胞对ECM的侵袭［ 1，2］。涎腺腺样囊性癌是最易发生血行转移的肿瘤之一，研究涎腺腺样囊性癌细胞与EC M的作用对探讨其转移机理是必要的。为此，本文研究了不同来源、不同转移潜能的人涎腺腺样囊性癌细胞与纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)、层粘连蛋白(laminin,LN)、Ⅳ型胶原的粘附，对人工重组基底膜的侵袭以及趋化运动。
材料和方法
　　1.细胞：人涎腺腺样囊性癌细胞SACC-83［3］和由此筛选的人涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞系SACC-LM(北京大学口腔医学院口腔颌面外科研究室)，人涎腺腺样囊性癌细胞ACC-2以及由此筛选而来的人涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞系ACC-M(上海第二医科大学口腔医学院口腔颌面外科实验室)［4］，用RPMI1640+15%小牛血清+双抗(青霉素 100u/ml、链霉素100u/ml)在37℃、5%CO2条件下培养。选用指数生长期的肿瘤细胞，用 0.125%胰酶/0.1%EDTA消化收集，D-Hank?s离心漂洗三次，无血清RPMI1640制成单细 胞悬液。
　　2.肿瘤细胞 -ECM粘附［5，6］：96孔平底细胞培养板(Costar USA),每孔分别加入FN 2.5μg、LN5μg、Ⅳ型胶原5μg(北京大学医学部细胞生物系)，4℃过夜，而后每孔加入0.1牛血清白蛋白(Sigma,USA)100μl，37℃孵育30分钟，以阻滞肿瘤细胞的非特异粘附；每孔加入肿瘤细胞5×104，37℃、5%CO2条件下孵育6小时，PBS轻洗三遍，去除未粘附细胞；每孔加MTT(Sigma,USA)0.2mg，孵育4小时；二甲亚砜(Sigma,USA)100μl， 室温过夜；Biorad 450酶标仪(Biorad Com,USA)测定在490nm的吸光值，参考波长为630nm，同时各种细胞分设阳性对照孔。以上实验均同时做三个平行孔，以所测吸光值与阳性对照孔 吸光值比值分别计算粘附率。实验结果进行t检验。
　　3. 肿瘤细胞对人工重组基底膜的侵袭［1，2］：改良Boyden chamber(北京大学医学 部病理系)，下室加入200μl NIH3T3无血清条件培养液作趋化液，上下室之间置放孔径为10 μm的聚碳酸酯微孔膜(Milipore,Ireland),膜上加Matrigel(北京大学医学部细胞生物系)20 μg,37℃孵育30分钟；上室加肿瘤细胞悬液400μl(SACC-83，SACC-LM细胞总数为3×105 ，ACC-2，ACC-M细胞总数为6×105)，37℃、5%CO2条件下孵育10小时，用棉签擦去微孔膜上室面的细胞，10%中性福尔马林固定，HE染色，将整个膜以“井”字划为9格，400×镜下观察，在中心格随机选一个视野，膜周边随机选四个格，各选一个视野，计数五个视野的 细胞总数。实验重复三次，结果进行t检验。
　　4.肿瘤细胞的趋化运动［1，2］：改良Boyden chamber,膜上不加Matrigel,上室加肿瘤细胞悬液400μl(SACC-83，SACC-LM细胞总数为2×105，ACC-2，ACC-M细胞总数为4×10 5)，其余同肿瘤细胞人工重组基底膜的侵袭。
结果
　　1.肿瘤细胞与ECM的粘附(表1)：四种肿瘤细胞与ECM的粘附率均小于50%，与不同E CM粘附率相差明显，依次为FN＞LN＞Ⅳ型胶原(P＜0.05)。SACC-LM与SACC-83相比，和FN、LN、Ⅳ型胶原的粘附下降(P＜0.05)；ACC-M与ACC-2相比，和FN、LN、Ⅳ 型胶原的粘附明显升高(P＜0.05)。