白斑癌变过程中α-SMA、墨汁灌注和病理分级相关性研究

钟鼓楼

　　提　要　目的：比较白斑癌变进程中几种血管生成检测方法与不同病理分级间的相关程度，探寻早期诊断白斑癌变的有效方法。材料与方法　采用 Salley法诱导金地鼠颊囊白斑癌变，以光镜下病理观察诊断分级和墨汁灌注、甲平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫组化等与血管生成有关的检测结果作相关性分析。结果：墨汁灌注图像分析结果中血管面积比与病理分级高度相关，血管密度值相关性不显著；α-SMA表达水平与病理分级有十分显著的相关性，且不同病理分级间的α-SMA阳性血管值有明显落差和平台。结论：多种检测手段均能有效地反映金地鼠白斑癌变进程中血管生成变化趋势和病理变化严重程度。α- SMA免疫组化检测具有十分良好的区分度，能准确反映上皮细胞变化程度，是很有临床实用价值的早期诊断白斑癌变的有效方法。
　　关键词　α-SMA　　墨汁灌注　　病理分级　　相关性
　　白斑癌变是由“正常细胞→上皮异常增生（轻度→中度→重度）→癌”的连续动态过程，具有清晰的组织病理分级〔1〕。同时，已有研究表明，血管生成与金地鼠颊癌有密切关系〔2〕。甲平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）是肌上皮细胞表达的一种细胞骨架蛋白，其表达水平能反映血管肌上皮细胞分化程度和血管基底膜完整程度，因而被广泛用于血管生成研究〔3〕。墨汁灌注后的组织病理切片中微血管清晰度得以提高，再用图像处理计算血管截面积和血管密度可提高观察精度，亦是常用的血管生成观察指标〔4〕。本文观察金地鼠颊囊白斑癌变过程中血管生成现象时采用的多种检测结果作相关性研究，以了解α-SMA、墨汁灌注图像分析等方法间接反映白斑癌变进程的准确性，为探寻早期诊断白斑癌变的有效方法提供实验依据。
　　材料与方法
　　1. 实验方法
　　1.1 实验动物。叙利亚品系金地鼠132只，清洁级，封闭群，周龄3周，体重80～100g。由上海西普尔—BK公司提供。
　　1.2 化学致癌剂。自行配制0.5％二甲基苯丙蒽（Dimethylbenzanthracene,DMBA）丙酮液。
　　1.3 免疫组化试剂。采用ABC试剂盒，DAKO公司提供。自行配置TRIS—HCL缓冲液（0.5M，pH7.6）。
　　1.4 明胶墨汁灌注液。自行配置：30g明胶溶于1000ml墨汁液中，在70～80℃水浴内加热，至充分溶解。
　　1.5 图像分析仪：采用KS400图像分析系统（Video Image Digital Analysis System），UNSP显微分光光度仪（Univesal Microspectrophotometer），由德国Zeiss公司提供。
　　2. 实验方法
　　2.1 实验动物分组。随机分为两大组：α-SMA组共102只，其中空白对照组6只，涂布DMBA 96只。于涂布4～9w各处死12只。墨汁灌注图像处理组30只，其中空白对照6只，涂布DMBA 24只。于涂布DMBA 4～9w各处死4只。每鼠左右颊囊可得2份标本。故α-SMA标本总计（96+6）×2=204例；墨汁灌注图像处理标本总计（24+6）×2=60例。上述两大组的金地鼠颊囊组织同时备份作组织病理光镜下观察，故组织病理标本数总计204+60=264例。
　　2.2 白斑致癌模型制作。乙醚麻醉金地鼠后，助手用大号镊撑开颊囊口，术者用纱布擦干颊囊粘膜后，用1号油画笔蘸取少量0.5％DMBA丙酮液以颊囊前静脉处为中心作圆周运动，涂布10次，范围1×1cm。涂布后禁食禁水2h。每周在相同部位涂布3次。连续4～9w。
　　2.3 α-SMA免疫组化检测。按预定时间点处死金地鼠后切取双颊囊粘膜组织，常规固定，石蜡包埋，连续切片2份。1份HE染色后光镜下行病理观察诊断分级（诊断分级按WHO 1972年关于上皮异常增生12项标准）；1份60℃烘箱内放置40min后置恒温箱内保持24～48h，然后作α-SMA免疫组化染色，采用ABC试剂盒。具体步骤为：常规脱蜡水化→微波处理修复丢失的抗原决定族（切片置缓冲液中洗涤5min×3次，再置0.1M柠檬酸缓冲液中在700W National微波炉内维护90～95℃微波处理10min)→染色前处理（缓冲液中洗涤5min×3次，0.2％Triton×100中10min，清水冲洗5min×3次，0.3％H2O2浸泡5min，5％牛奶中孵育30min)→常规ABC法 α-SMA染色。每例标本在低倍镜下找到典型区后转高倍镜观察。计数相邻3个视野内α-SMA连续性染色血管数，并按α-SMA阳性血管数／视野内血管总数×100％计算α-SMA阳性血管密度值（简称α-SMA值）。