p16基因在口腔鳞癌中的缺失及其临床意义

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　　【摘要】目的：探讨p16基因的缺失表达与口腔鳞状细胞癌(SCC)发生发展的关系。方法：应用RT-PCR及免疫组化方法检测30例口腔鳞癌中p16基因的缺失表达。结果：30例口腔鳞癌患者中16例存在p16的缺失，缺失率为53.3%。p16基因的缺失表达与口腔鳞癌的临床分期及淋巴结有无转移有关系(P＜0.05)。结论：p16基因缺失可能参与了口腔鳞癌的癌变过程，p16基因的缺失表达可作为估计口腔鳞癌患者预后的一个重要指标。
　　【关键词】口腔鳞癌　　RT-PCR　　免疫组化　　p16基因
　　p16基因是Serrano[1]在与细胞周期素依赖激酶(CDK)相结合蛋白质研究中发现的，是一种非常重要的多肿瘤抑制基因。目前研究表明 p16基因及其产物在人类很多原发性肿瘤的细胞株中存在缺失和突变，如脑肿瘤、肺癌、膀胱癌、肾肿瘤、卵巢癌、黑色素瘤、白血病等[2]。为了研究p16 基因缺失与口腔鳞癌发生、发展的关系，本文利用RT-PCR及免疫组化技术对30例口腔鳞癌患者进行了检测。
　　材料和方法
　　1.30例口腔鳞癌及5例正常口腔粘膜组织均来自本院活检标本，新鲜手术标本取一半于15分钟内放于液氮中保存，另一半用中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，每例标本均连续切片2张，其中一张常规HE染色作病理诊断，临床和病理分类标准按国际抗癌联盟(UICC)1987年制定标准划分，其中Ⅰ期 10例，Ⅱ期12例，Ⅲ期5例，Ⅳ期3例，伴局部淋巴结转移8例。高分化6例，中分化13例，低分化11例。
　　2.主要试剂：PCR Marker;dNTP,MMLV;Rasin;Taq酶均购于华美公司。p16多克隆抗体及SP即用型试剂盒均为迈新生物技术开发公司产品。
　　3.实验方法：①组织RNA的提取：参照Chomczynski方法［3］略作修改。②RT-PCR：本实验选用扩增p16基因的两个外显子 (exon1-2)和作为内对照的β2-微球蛋白。p16引物序列为5’-AGC CTT CGG CTG ACT GGC TGG-3’；5’-CTG CCC ATC ATG ACC TGG-3’，扩增长度428bp［4］。反转录：随机引物引导下合成cDNA；PCR扩增：在反转录体系中加入5μl 10倍PCR缓冲液，0.5mmol/L dNTP,30pmol引物和2U的Taq酶，然后加水至50μl，94℃1min,55℃30秒，72℃1min,30个循环后72℃延伸5min，反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。③免疫组化：按照SP即用型试剂盒提供的方法进行。阳性对照片由迈新生物技术开发公司随试剂配套提供。阴性对照以PBS置换一抗作阴性对照，结果观察采用半定量积分法，即对每张切片阳性细胞所占比例及阳性细胞着色强度分别打分，染色强度与阳性细胞所占百分率的积分乘积＞3才能确定为免疫反应阳性。
　　结果
　　1.RT-PCR结果：琼脂糖凝胶电泳显示所有标本均呈现完整的β2-微球蛋白条带，无缺失及异常条带，表明模板质量可靠，5例正常粘膜组织标本均可检测到p16的PCR产物，但30例鳞癌中仅14例可以检测到p16扩增产物，提示这些标本中存在p16基因的缺失，发生率为53.3% (16/30)(图1、2)。
　　图1　正常口腔粘膜组织及鳞癌组　织的RT-PCR结果(略)
　　M：Marker；N1-N5：正常口腔　粘膜组织；T1：口腔鳞癌
　　MT2T3T4T5T6T7T8
　　图2　口腔鳞癌组织的RT-PCR　结果(略)
　　M：Marker；T2-T8：口腔鳞癌　组织(T7显示p16条带，其余缺失)
　　2.免疫组化结果显示：P16蛋白阳性表达在鳞癌细胞核浆中均见表达，30例口腔鳞癌中12例P16蛋白阳性表达，2例弱阳性表达，P16蛋白的失表达与p16 mRNA缺失之间有显著相关性(P＜0.05)。
　　3.p16 mRNA P16蛋白表达与临床病理指标的关系：p16基因的缺失与肿瘤的临床分期有关，Ⅲ、Ⅳ期p16表达率明显低于Ⅰ、Ⅱ期，淋巴结转移组的表达率明显低于淋巴结未转移组(附表)，推测p16基因缺失表达可能与口腔鳞癌的恶性进展有关。
　　附表　30例SCC中p16 mRNA P16蛋白表达(略)
　　与临床病理指标关系
　　注：*为p16 mRNA表达阳性各组相比所得P值；**为P16蛋白表达阳性各组相比所得P值