口腔粘膜上皮异常增生和鳞癌组织中凋亡蛋白Bax的表达研究
【摘要】 目的 研究凋亡相关蛋白Bax在口腔正常粘膜、上皮异常增生和鳞癌组织中表达及意义。方法 采用免疫组化方法检测10例正常粘膜、10例单纯性增生上皮、32例异常增生上皮、19例高分化鳞癌、9例低分化鳞癌石蜡包埋样本中Bax的表达。结果 正常粘膜中见Bax弱表达局限于角化层。上皮单纯增生时Bax表达较正常组增强，轻度异常增生时反而较单纯增生下降，随异常增生程度加重，Bax明显增加。癌变时Bax表达较重度异常增生下调，且高分化鳞癌Bax表达明显高于低分化鳞癌。结论 Bax蛋白表达水平代偿性增高是口腔癌前病损发生发展中的早期事件。Bax表达下调将导致癌细胞过度积留产生癌变并与其预后相关。
【关键词】 上皮异常增生 鳞癌 Bax
许多证据表明细胞凋亡的调节异常与某些肿瘤的发生相关，凋亡调控基因已被看作一类新的肿瘤相关基因［1，2，3］。鳞癌是口腔中最常见的恶性肿瘤，约占口腔肿瘤的90%以上，且5年生存率不足50%，而口腔粘膜上皮异常增生做为癌前病变约有4%～16%的癌变率［4，5］，所以对其发生演变的病因学研究尤为重要。本文采用免疫组化方法研究凋亡基因产物Bax抗原在口腔正常粘膜、单纯增生上皮、口腔异常增生上皮和口腔癌组织中的表达，以期探讨它与口腔癌前病变、鳞癌的发生发展的关系。
材料和方法
1.标本：选择1995年～1998年北京医科大学附属口腔医院病理室保存资料完整的石蜡包埋组织80例，其中正常口腔粘膜10例、单纯上皮异常增生10例、上皮轻度异常增生11例、中度异常增生13例、重度异常增生8例、高分化鳞癌19例、低分化鳞癌9例。
2.试剂：兔抗人Bax多克隆抗体、SP试剂盒均为Santa Cruz公司产品。
3.免疫组化染色方法：切取5μm厚石蜡切片常规脱蜡水化后，用39%H2O2甲醇溶液抑制内源性过氧化物酶后，置于柠檬酸缓冲液(pH6.0)中水浴微波处理进行抗原修复。再用10%正常绵羊血清封闭10分钟，Bax抗体稀释度为1：80，生物素化二抗体为1：150，链条和素为1：150，采用SP法染色，显色底物为DAB。每次实验均用已知阳性片作为阳性对照，以PBS代替一抗为阴性对照。
4.判断标准：Bax阳性反应为黄到棕黄色颗粒，定位于胞浆，根据Nakagawa等提供的方法，高倍镜下进行计数：标本中无阳性细胞为0分，＜25%为1分，26%～50%为2分，50%以上为3分，染色强度以淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。两者相乘，0分为阴性(-)；1～3分为弱阳性(+)；4～6分为中等阳性(++)；7～9分为强阳性(+++)。
结 果
10例正常口腔粘膜有7例出现Bax阳性表达，表达程度较均一，为弱阳性表达，主要局限于角化层浅表细胞，而在上皮单纯增生的10例标本中可见Bax阳性表达的细胞数和强度均较正常粘膜明显增加，但仍以颗粒层和棘细胞浅层细胞着色最深，中等强度以上阳性率为60%。随着上皮异常增生的出现，Bax表达总的阳性率虽然没有明显的改变(单纯增生和轻度异常增生相比，P＞0.05)，但阳性细胞数和着色程度却明显下调，中等程度以上阳性率下降为33.3%。当上皮出现中度和重度异常增生时，Bax表达较轻度异常增生时再次呈现增强趋势(图1)，中等程度以上阳性率上升到76.7%和87.5%。
在鳞癌组织中，19例高分化鳞癌中出现中等程度以上阳性染色13例(占68.4%)，阳性细胞弥漫分布于肿瘤全层，且在分化较好的癌巢中央细胞多为Bax强着色，而癌巢周边的细胞则着色较淡(图2)，这个结果与Jordon等［6］的观察相一致。各级上皮异常增生粘膜和鳞癌组织Bax的表达情况见表1。单纯增生与轻度异常增生无显著性差异P＞0.05；单纯增生与正常粘膜、重度异常增生与高分比化癌、高分化鳞癌与低分化鳞癌均有显著性差异P＜0.05。
表1 口腔正常粘膜、上皮单纯增生、异常增生和鳞癌组织中Bax的表达比较
组别例数-++++++
正常粘膜1037 00
单纯增生100442
轻度异增110731
中度异增131264
重度异增80107
高分化鳞癌1915103
低分化鳞癌97110
讨 论
Bax是一种由192个氨基酸残基组成的，分子量为21KD的蛋白质，具有一个跨膜位点，与Bcl-2的同源性为21%，属Bcl-2家族，为促细胞凋亡的一类分子。当Bax形成自身Bax/Bax二聚体时，促进细胞凋亡；与Bcl-2结合成异二聚体时则失去活性［7］。本研究中正常口腔粘膜出现Bax表达，可能正常口腔粘膜中Bax参予了细胞生理死亡的调节。正常口腔粘膜复层鳞状上皮细胞由底部基底层的细胞发生，向上移行，分化成熟至表面逐渐衰老死亡。凋亡蛋白Bax弱表达局限于角化层细胞，符合口腔粘膜上皮细胞移行成熟的生理特征。对于细胞分化和细胞凋亡，有学者认为这是两个不同的过程，也有的学者认为是同一过程［8］。促进细胞凋亡的基因蛋白Bax局限于分化成熟的角化层，推测口腔粘膜这一特定的鳞状上皮中其分化和凋亡可能是同一过程，至少存在着某种相同的途径。
除低分化鳞癌外，各组与正常粘膜相比，其Bax的表达均有显著性差异。当上皮出现单纯性增生时，Bax表达明显增强，这可能是机体一种自我保护功能的表现，它通过Bax表达加强来促进凋亡进而拮抗细胞的增殖，维持细胞数目的稳定。而当单纯增生演变成轻度异常增生时，Bax中等程度以上阳性表达率反而出现下降，可能是异常增生发生时，机体某些新的基因开始启动，且它们能拮抗Bax的作用，从而使其表达呈现一过性降低。随着上皮异常增生程度的加剧，恶性转化的细胞分裂周期短，机体经过一段时间适应后，Bax又进一步代偿性增加以促进异常增殖细胞的凋亡，抗衡异常上皮细胞增殖，中等强度以上的阳性表达率再次明显增加。
上皮重度异常增生演变成鳞癌组织时，多种促癌细胞增殖基因的作用得以充分发挥，机体凋亡代偿能力则达到极限开始表达下调，导致癌细胞生存时间过度延长，造成癌细胞聚集而形成肿瘤。另外，其结果亦显示Bax表述程度与鳞癌分化程度有关，分化程度高者Bax阳性率高(94.7%)，通过Bax途径发生凋亡的肿瘤细胞增多，则鳞癌的恶性程度低，侵袭性弱，预后可能较好。低分化患者Bax阳性率低(22.2%)，通过Bax途径发生凋亡的细胞数少，则鳞癌的恶性程度高，侵袭性强，预后差，因此Bax的表达强度在一定程度上能反应鳞癌的预后。
通常Bax阳性着色定位于胞浆，也可见于胞膜和核膜，然而本实验中亦出现了3例核着色阳性的细胞。核染色所显示的意义不太清楚，不过这种核染色可能代表Bax的另一异构体形式。Bax最常见的是分子量为21KD的蛋白体(BAXα)。但Krajewki等人曾描述了另外两种Bax形式BAXβ和BAXγ，从cDNA结构预测它们的分子量分别为24KD和5KD，与BAXα不同，这些形式的Bax分子可能因缺乏跨膜位点，因而仅显示核染色。因为核着色显示的意义不清，本实验仅计算那些胞浆着色的细胞为阳性细胞。
本研究从一个侧面反映口腔粘膜上皮异常增生时，机体试图通过Bax表达上调来拮抗细胞的恶性增殖。而一旦这种功能受抑制则可能导致鳞癌的发生，且鳞癌组织Bax表达与癌细胞的分化呈相关，可能对其预后有一定的影响。
作者单位：关为群（100081 北京医科大学口腔医学院病理研究室）
于世凤（100081 北京医科大学口腔医学院病理研究室）
高岩（100081 北京医科大学口腔医学院病理研究室）
参考文献略
是一套功能强大的网 站管理工具，
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